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细胞冻存盒的实验步骤,您都知道吗?

更新时间:2021-12-01      点击次数:2223
  什么是细胞冻存?
  细胞长势良好,供大于求时,就可以考虑把细胞冻存起来,以后再用。当温度低于-70℃时,细胞内的酶活性全部停止,代谢活动停止,故可以达到长期保存的目的。随着温度降低,细胞内外的水分都会结晶,所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏,从而引起细胞死亡,特别是-20-0℃的阶段,冰晶呈针状,及容易引发细胞损伤。
  细胞冻存盒的基本原则是缓慢冷冻,实验证明这样可以大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
  细胞冻存盒的实验步骤:
  1.配制含10%DMSO、20%小牛血清的冻存培养液4mL。
  2.取出生长良好的细胞。
  3.吸除旧的培养液:拿出吸管(要拿吸管的上端),插入与抽滤瓶相连的橡胶管中,在酒精灯外焰灼烧灭菌,细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角,吸出旧的培养液,将用后的吸管弃于废弃缸里。
  4.消化:拿出5mL移液管,插入电枪中,酒精灯过火灼烧,吸取2mL0.25%胰酶,混匀,放于37℃孵箱中消化5-6min。取下用后的移液管。
  5.中和:从孵箱中拿出培养瓶,显微镜下观察细胞是否被*消化下来,5mL灭菌后移液管加入3mL培养液终止消化。
  6.离心收集细胞:配平后离心200×g,3min。将新培养液加入新培养瓶中,2mL/瓶(培养瓶底面积为25cm2)。
  7.分装冻存:将细胞分装入冻存管中,每管1mL。
  8.在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;
  9.冻存:细胞冻存盒,里面有异丙醇,直接放入-80过夜,冻存盒自动缓慢降温。然后-196℃液氮保存。
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