细胞冻存盒的实验步骤，您都知道吗？

　　什么是细胞冻存？

　　细胞长势良好，供大于求时，就可以考虑把细胞冻存起来，以后再用。当温度低于-70℃时，细胞内的酶活性全部停止，代谢活动停止，故可以达到长期保存的目的。随着温度降低，细胞内外的水分都会结晶，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏，从而引起细胞死亡，特别是-20-0℃的阶段，冰晶呈针状，及容易引发细胞损伤。

　　细胞冻存盒的基本原则是缓慢冷冻，实验证明这样可以大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

　　细胞冻存盒的实验步骤：

　　1.配制含10%DMSO、20%小牛血清的冻存培养液4mL。

　　2.取出生长良好的细胞。

　　3.吸除旧的培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。

　　4.消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL0.25%胰酶，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。取下用后的移液管。

　　5.中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被*消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL培养液终止消化。

　　6.离心收集细胞：配平后离心200×g，3min。将新培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。

　　7.分装冻存：将细胞分装入冻存管中，每管1mL。

　　8.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

　　9.冻存：细胞冻存盒，里面有异丙醇，直接放入-80过夜，冻存盒自动缓慢降温。然后-196℃液氮保存。