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实时荧光定量PCR仪使用的基本步骤

更新时间:2022-04-12      点击次数:3053
  实时荧光定量PCR仪技术的原理:体外核酸扩增,加热使双链DNA解开螺旋,在退火温度条件下引物同模板DNA杂交,在Taq DNA聚合酶,dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸),Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物,重复“变性→退火一引物延伸”过程至25-40个循环,呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。简单的说,PCR仪就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。
  实时荧光定量PCR仪使用的基本步骤:
  ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃(左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
  ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
  ③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
  实时荧光定量PCR仪重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。
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