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快速病毒检测 | 特定引物和探针在助力RPA检测成为SVV快检有效工具

更新时间:2022-05-30      点击次数:659


畜牧业是我国经济发展的重要组成部分,对于基层养猪户来说,由于受多种外在因素的影响,养猪场会出现多种猪类相关疾病。对于猪场养殖户来说,猪仔患病,如果诊断治疗不及时,有可能带来巨大的经济损失。常见猪类疫病如口蹄疫等多是由病毒引起,塞内卡谷病毒(SVV)也是其中一种。

 

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山东师范大学生命科学学院硕士研究生导师陈蕾教授课题组在《Analytical Biochemistry》新发表了题为Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Seneca Valley Virus 的研究论文,探讨研究了重组酶聚合酶扩增 (RPA)快速检测SVV的方法。

 

 


摘要内容

塞内卡谷病毒(SVV)的快速准确检测对于确定致病因素和启动控制措施的实施至关重要。 开发可在样品采集点使用的快速、简单、方便和低成本的分子(核酸扩增)测试方法已被确定为控制塞内卡谷病毒(SVV)的关键要素。作者研究团队描述了针对 SVV 保守区域的重组酶聚合酶扩增 (RPA) 测试的开发,以用于检测 SVV。 研究人员设计的引物和探针在RPA检测中表现出良好的敏感性和特异性,有助于RPA成为快速诊断SVV的有效工具。

 

背景介绍

2002年,美国研究人员偶然从PER.C6细胞(转化的胎儿成视网膜细胞)培养基中首(shou)次发现并分离到一种新的病毒——塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV,又Seneca virus A,SVA)。塞内卡谷病毒(Seneca Valley Virus,SVV)属于小RNA病毒科塞内卡谷病毒属中的一员,临床症状与其他水疱病临床症状如口蹄疫类似,引起新生仔猪大量死亡和成年猪口部和蹄部出现水泡。 

2002年确定以来,SVV主要在美国和加拿大零星散发,但自2014年年底后,SVV先后在多个国家大范围流行。2015年传入中国以后,SVV先后在福建、广州、湖南、湖北、安徽、江苏、浙江、河南、河北、辽宁、黑龙江等12个省份引发疫病。塞内卡谷病毒(SVV)传播特性与口蹄疫病毒类似,且与口蹄疫病毒存在混合感染,严重干扰了口蹄疫的防控。

目前多种分子技术手段已被用于检测塞内卡谷病毒(SVV),包括聚合酶链式反应 (PCR)、滚环扩增 (RCA) 和环介导等温扩增 (LAMP) 等。 在现有的等温扩增技术中,重组酶聚合酶扩增 (RPA) 可能是最(zui)适用于现场和即时诊断(point-of-need diagnosis)的方法

RPA利用低温孵育(37–42℃)进行反应 ,只需最少的样品制备,且扩增时间短(约20分钟),灵敏度高(每个反应1-10 copies)。本研究介绍了SVV保守区引物和探针的设计,并评估了其在RPA实验中的表现。

 

 

实验方法:

试验中用到的塞内卡谷病毒(SVV)cDNA、口蹄疫病毒 (FMDV) cDNA、猪呼吸与生殖综合征病毒 (PRRSV) cDNA、猪瘟病毒 (CSFV) cDNA、猪流行性腹泻病毒 (PEDV) cDNA、传染性胃肠炎冠状病毒 (TGEV) cDNA和阴性猪cDNA均由山东省疾病预防控制中心提供。本研究中使用的病毒样本均在阴性猪cDNA 中稀释到一定浓度。经基因工程技术把靶标基因克隆装载到特定载体中,得到重组质粒 pET-32a SVV,重组质粒浓度为300 ng/μL。类似实验操作的得到其它病毒质粒 (pET-32a-FDMV, pET-32a-PRRSV, pET- 32a-CSFV, pET-32a-PEDV, pET-32a-TGEV)。

之后设计并合成特定引物及探针,进行重组酶聚合酶扩增 (RPA) 测试,实验反应在等温扩增荧光检测仪(H1600,柏恒科技)上进行,在 42°C 温度条件下开始扩增,反应约20分钟。产生高于阴性对照阈值的指数扩增曲线的样品被认为是阳性的。后续研究团队对RPA进行了特异性、敏感性及重复性的分析,结果均显示良好。

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结论:

该研究描述了RPA法检测SVV的特异性引物和探针,具有良好的灵敏度和特异性,快至8分钟即可产生阳性结果,一般不超过20分钟。 塞内卡谷病毒(SVV)RPA检测是在柏恒科技的等温扩增荧光检测仪H1600上进行的,仪器体积小,重量轻,方便携带。

实验结果表明,特异性引物和探针有助于RPA技术成为SVV快速检测的良好候选技术。它可以检测患病动物,以便及时治疗和控制感染传播。

 

实验中用到的等温扩增荧光检测仪H1600为柏恒科技生产,仪器检测快速,体积小,可用于便携式操作,适用牧场、林场、动物疫病检测等多场景。

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此外柏恒还提供动物疫病检测解决方案,我们提供包括离心机、金属浴、PCR仪等全流程实验仪器,更多内容,欢迎咨询联系。

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参考文献:

[1] A.J. Bracht, E. O’Hearn, A.W. Fabian, R.W. Barrette, S. Abu, K. Bernhard, Real-time reverse transcription PCR assay for detection of senecavirus A in swine vesicular diagnostic specimens, PLoS One 11 (1) (2016), e0146211.

[2] M.E. A, Y.W. B, O.N. C, O.P. C, F.T.H. A, M.W. A, Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Rift Valley fever virus, J. Clin. Virol. 54 (4) (2012) 308–312.

[3] M. Euler, Y. Wang, P. Otto, H. Tomaso, M. Weidmann, Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of francisella tularensis, J. Clin. Microbiol. 50 (7) (2012) 2234–2238.

[4] J. Wang, Y. Zhang, R. Zhang, Q. Han, J. Wang, L. Liu, R. Li, W. Yuan, Recombinase Polymerase Amplification Assay for Rapid Detection of Porcine Circovirus 3, Molecular & Cellular Probes, 2017, S0890850817300890.

 

 


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