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实时荧光定量PCR仪使用注意事项

更新时间:2022-06-20      点击次数:1443
  实时荧光定量PCR仪指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR(qPCR)中,反应以循环中检测到目标扩增的时间点为特征,而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高,则会越快观察到荧光的显著增加。相反,终点法检测(也称“读板检测”)测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。
 
  实时荧光定量PCR仪注意事项:
  1.在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA断裂。
  2.为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。
  3.内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
  4.PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。
  5.防止DNA的污染:采用DNA酶处理RNA样品,在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。
  6.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
  7.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
  8.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。
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