【柏恒科技小课堂】PCR扩增总是出现杂带？高效解决方法来了！

[ PCR出现杂带的处理办法]

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PCR（聚合酶链式反应）和凝胶电泳是分子生物学研究中常用的技术，它们通常结合使用以鉴定和分析PCR扩增产物。然而，在进行PCR凝胶电泳时，经常会在电泳图谱中发现杂带，这些杂带可能会干扰实验结果，甚至导致实验失败。

本文将探讨PCR凝胶电泳过程中杂带的成因，并提供一些可能的解决方案。

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PCR条件优化： 调整PCR反应条件，退火温度过低会导致引物与模板的非特异性结合，从而引发非特异性扩增；退火温度过高则可能抑制引物与模板的正常结合，影响扩增效率。可以通过梯度PCR实验逐步确定最佳的退火温度 一般而言，PCR反应的退火步骤的温度通常在50°C到68°C之间，具体取决于引物的碱基序列和目标DNA的特性。有些引物需要更高的退火温度来确保特定区域的特异性结合，但一般情况下，最高退火温度不会超过68°C。

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引物设计不合理：如果引物长度过短、序列重复或含有高GC区域，可能导致引物与模板的非特异性结合，进而产生杂带。需要重新设计引物，确保引物的长度适当、序列不重复、GC含量适中，并避免在引物内部或引物与模板的结合区域出现高GC区域。

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引物用量不当：引物用量过大或特异性不高，可能会导致非特异性扩增，从而产生杂带。建议调换引物或降低引物的使用量。

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模板不纯：模板DNA中含有杂质，如蛋白质、RNA或其他非目标DNA片段，可能作为PCR扩增的模板，导致额外条带的出现。

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模板降解：模板DNA在提取或储存过程中发生降解，产生的小片段DNA可能成为非特异性扩增的模板。

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纯化模板DNA：PCR实验中的模板DNA可以来自多种来源，包括基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）以及质粒DNA等。然而，不同来源的DNA在组成和复杂度上可能有所不同，这会影响PCR扩增的最佳起始量。例如，在50 µL的PCR反应中，质粒DNA仅需0.1–1 ng，而gDNA则需要5–50 ng。此外，所使用的DNA聚合酶类型也会对最佳模板起始量产生影响。经过改造的DNA聚合酶对模板的亲和力更强，灵敏度更高，因此所需的DNA起始量相对较少。优化DNA起始量至关重要，因为起始量过高可能导致非特异性扩增的风险增加，而起始量过低则可能降低PCR的得率。有时，PCR实验方案会使用拷贝数来表示DNA起始量，特别是对于gDNA。拷贝数的计算涉及Avogadro常数和摩尔质量，具体公式为：拷贝数 = L × 摩尔数 = L ×（总质量/摩尔质量）。

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Mg²⁺浓度过高：Mg²⁺是PCR反应中的重要成分，但其浓度过高会降低PCR扩增的特异性，增加非特异性扩增的风险。需要通过实验确定最佳的Mg²⁺浓度。

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酶的用量或质量不佳：酶的用量过高或酶的质量不好，都会影响PCR反应。建议降低酶量或更换另一来源的酶。

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使用热启动PCR： 热启动PCR可以减少反应在低温度时可能引起的非特异性扩增。

热启动PCR是一种用于减少非特异性扩增的技术。在常规PCR中，当反应温度升高到扩增温度之前，引物可能已经结合到模板DNA上。这可能导致在PCR开始阶段就发生非特异性扩增，产生杂带或假阳性结果。热启动PCR通过在PCR反应中添加热稳定的DNA聚合酶来解决这个问题。

热启动PCR的关键是使用一种需要高温激活的聚合酶。这样的酶在较高温度下才会变活跃，因此在反应开始时才会开始扩增目标DNA序列，而不会在低温时引发非特异性反应。

一些常用的热启动聚合酶包括热稳定的Taq聚合酶的改良版本，例如具有热活化域的Taq DNA聚合酶，以及Pfu或Phusion等高保真度聚合酶。

所以现在的酶基本上都满足条件。

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检查实验室环境： 避免DNA污染及实验仪器的污染，使用无菌技术和经过处理的试剂，保持实验室清洁。

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梯度优化PCR：使用温度梯度进行PCR反应，寻找特异性扩增的温度。

柏恒科技智能二维梯度PCR仪可在在同一反应中同时优化变性及退火的温度梯度变性可设横向8行变性梯度纵向可设12列退火温度，从而来优化最佳的退火温度，从而提高PCR反应的特异性和效率。

这个技术对于优化引物、模板和PCR条件非常有用，以确保获得高质量和特异性的PCR产物。

这些方法可以单独或结合使用，帮助减少或消除PCR杂带问题。