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在上一期的qPCR反应漫谈中，从一开始沃森和克里克两位基因学奠基人的两个论点简单延伸至染料法和探针法两类常见的qPCR反应。
这一期做一个从PCR反应过程出发到一些实验问题优化的分享。
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(先抛砖）PCR反应原理：
PCR通过变性、退火和延伸三个步骤的循环往复，模拟DNA在体外扩增的过程：
1. ?变性?：通过加热使双链DNA解开成为两条单链，温度通常在95℃左右。
2. ?退火?：降低温度至55-70℃，使引物与单链DNA模板上的互补序列结合。
3. ?延伸?：在适宜的温度下（72℃左右），DNA聚合酶以引物为起点，合成新的DNA链。
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然后围绕着这三点需要确认：
1. 变性的时间足够吗？在变性阶段，DNA是不是已经解旋为单链？
2. 退火温度（Tm值）设置的合理吗？探针的Tm值是不是比引物的Tm值高，已先于引物结合在模板上？上下游引物的Tm值是不是接近，有近似的扩增效率？
3. 延伸温度是否足够，延伸时间是否足够，是否了解所用聚合酶的特性？
首先，DNA成为单链是引物可以顺利结合的前提，如果没有经过充分的解旋，扩增效率肯定会大受影响（等温扩增不在此列）。比如扩增cDNA变性大概10sec就够，扩增质粒则往往要30sec及以上。
其次，荧光探针需要先于引物结合到模板上，不论是水解探针还是蝎形探针。否则就会出现变性好的单链DNA在引物和酶的作用下都已经补齐了另一条链了，探针还在一边傻傻的说：“我没上车啊~"
最后，常规的qPCR扩增片段一般在200bp左右，延伸时间设定30-45sec也基本够用。至于说延伸温度，多会把退火和延伸合并为一步，温度采用60℃。但是有些反应，因为整体的反应优化不太理想或者是反应自身的一些固有限制，两步法扩增的效果不够好，此时可以使用三步法扩增，提高产物积累。采用三步法扩增时有个值得推敲的点，信号收集该是在退火阶段还是延伸阶段？染料法、水解探针、蝎形探针的答案并不一样，可自行推导一番然后理论联系实际验证一下。
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