实时荧光定量PCR仪(qPCR仪) 是一种基于聚合酶链式反应技术的分子分析仪器,通过实时监测PCR扩增过程中的荧光信号变化,实现对DNA或RNA的高灵敏度定量分析,是生命科学研究、临床诊断和公共卫生领域的核心设备。
根据荧光标记方式不同,主要分为两类:
荧光染料法:染料与双链DNA结合后释放荧光,实验设计简单、成本低,但需配合熔解曲线验证产物特异性,避免假阳性。
荧光探针法:探针两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团,在Taq酶作用下切割后释放荧光,特异性高、支持多重检测,是临床诊断的主流方案。
实验前准备操作要点:
所有试剂、模板全程在冰上操作,避免Taq酶失活;试剂避免反复冻融,现配现用,优先用预混液配制大体系,大幅减少移液次数降低随机误差。
耗材优先选白色96孔板、高透光学封板膜和0.2mm薄壁管,白色板比透明板荧光信号增强30-40%,薄壁管热传导效率提升25%,适配低丰度靶标检测。
每批实验必须设置无模板阴性对照(NTC)和阳性对照,提前验证引物特异性,确保熔解曲线为单峰,无引物二聚体或非特异性扩增干扰。
核酸样本需验证完整性,RNA样本RIN值≥7.0,用Qubit荧光法定量浓度,去除残留的肝素、酚类等PCR抑制剂,避免抑制扩增效率。