详解非洲猪瘟PCR仪检测方法

　　采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g~0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1l的0.01mol/LPBS（pH7.2）制成匀浆，经10000r/min离心取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5皿离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。

　　非洲猪瘟PCR仪病毒DNA提取方式：

　　1、DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。

　　2、待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5l离心管，逐管编号。

　　3、每管加入200uLDNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200uL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃~25℃条件下，13000r/min离心10min。

　　4、尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10uLDNA提取液2，混匀器上震荡混匀5s。于4℃~25℃条件下，2000r/min离心10s。

　　5、100℃干浴或沸水浴10min。

　　6、加入90uL无DNA酶的灭菌去离子水，13000r/min离心10min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。

　　非洲猪瘟PCR仪操作步骤：

　　1、在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行提取。

　　2、每个检测反应体系需使用20uL实时荧光PCR反应液。充分混匀后分装，每个PCR反应管20uL。转移PCR反应管至样品制备区。

　　3、反应管中分别加入提取的DNA溶液5L，使每管总体积达到25L，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。

　　4、将加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下：预变性95℃/3 min；95℃/15s，52℃/10s，60℃/35s，45个循环；在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。

　　非洲猪瘟PCR仪检测阀值设定原则：阀值线超过阴性对照扩增曲线的高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。