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荧光定量PCR的理论依据是什么?

更新时间:2022-01-11      点击次数:782
  荧光定量PCR在反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化。从而得到一条荧光扩增曲线。荧光扩增曲线包括3个阶段:基线期,扩增期和平台期。
  只有在荧光信号扩增期,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,所以可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量PCR反应的指数期,需要设定一定荧光信号的阈值,一般这个阈值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本地信号,荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
  荧光定量PCR的理论依据是什么?
  特定的待扩增基因片段起始含量越大,则指数扩增过程越短,当扩增速率趋于稳定后,则无论原来样品中起始模板含量多少,扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结果:Y=X×2"其中Y代表扩增产物量,X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数;理论上PCR扩增效率为100%,PCR产物随着循环的进行成指数增长,但实际上:DNA的每一次复制都不*,即每一次扩增中,模板不是呈2的倍增长;实际应为:Y=X(1+E)",其中E代表扩增效率:E=参与复制的模板/总模板,通常E≤1,E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X在1~105拷贝、循环次数n≤30时,E相对稳定,原始模板以相对固定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n的增加(>30次),E值逐渐减少,Y呈非固定的指数形式增加,进入平台期。
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