荧光定量基因扩增仪的操作步骤速查表

工作原理：

仪器通过荧光染料或荧光标记探针，实时追踪每一轮PCR循环后的核酸扩增产物总量，将荧光信号变化转化为可量化数据；通过绘制标准曲线，结合循环阈值（Ct值）精准计算出未知样本的初始模板DNA浓度，实现“边扩增、边检测”，无需后续开盖电泳处理，全程闭管操作避免交叉污染。

操作步骤速查表：

开机前5项必查：

确认仪器散热口无遮挡，环境温度稳定在‌20~30℃‌

准备无酶无热源光学级耗材，禁止使用普通PCR管

所有试剂提前冰上解冻，全程佩戴无粉手套操作

确认热盖硅垫清洁无破损，加热块适配当前耗材规格

提前完成核酸样本质控，OD260/280值在‌1.8~2.0‌区间

体系配制核对清单：

按「预混液→引物→无酶水→最后加模板」顺序加样，降低交叉污染

20μl常规体系各组分体积误差控制在±0.2μl以内

加样后轻弹管壁混匀，瞬时离心1分钟清除管底气泡

所有样本、NTC阴性对照、阳性对照均设置3个技术复孔

染料法实验提前确认SYBR Green对应FAM通道，避免选错荧光通道

上机运行关键校验：

布板信息与实际孔位100%对应，无错配漏标

热循环程序参数核对：预变性95℃ 2min → 40个循环（95℃15s→55~65℃30s→72℃30s）

染料法必须增设65~95℃熔解曲线程序，升温速率0.1℃/s

反应板平稳放入样品槽，确认贴合加热块后再关闭热盖

运行全程禁止打开仪器盖，避免温度波动影响扩增效率